Geneetiliste uuringute läbiviimise käigus kohtame sageli ebapiisavaid RNA proove, näiteks pisikeste anatoomiliste suukasvajate, isegi üherakuliste proovide ja spetsiifiliste geenimutatsioonide proovide uurimiseks, mis transkribeeritakse inimese rakkudes väga madalal tasemel.Loomulikult on COVID-19 testi jaoks, kui tampoonid ei ole õiges kohas või proovide võtmisel pole piisavalt kordi, valimi suurus väga väike, mistõttu tuli tervise- ja pereplaneerimise komisjon kaks päeva tagasi välja ja testi läbis ja kui nukleiinhappeproovi võtja kuut proovi ei võtnud, võite sellest teatada.
Reaktiivi tundlikkus on oluline, kuna meil on see või see probleem, nii et mida saame teha RT-PCR tundlikkuse parandamiseks?
Enne võimalike lahenduste arutamist mainigem kahte suurt komplikatsiooni seoses just mainitud olukorraga.
Esiteks muretseme RNA kadumise pärast, kui meie proovis on vaid mõned rakupopulatsioonid.Kui kasutatakse traditsioonilisi eraldamis- ja puhastusmeetodeid, näiteks kolonnmeetodit või nukleiinhappesadestamise meetodit, on suur tõenäosus, et vähesed proovid lähevad kaotsi.Üks lahendus on lisada kandja molekul, näiteks tRNA, kuid isegi sel juhul pole garantiid, et meie taastumiskatse on korras.
Mis on siis parem viis?Kultiveeritud rakkude või mikroanatoomiliste proovide jaoks on hea võimalus kasutada otsest lüüsi.
Idee on jagada rakud 5 minutiks, vabastada RNA lahusesse, seejärel peatada reaktsioon 2 minutiks, seejärel lisada lüsaat otse pöördtranskriptsiooni reaktsioonile, et RNA ei läheks kaduma, ja lõpuks panna saadud cDNA otse. reaalajas reaktsiooni.
Aga mis siis, kui piiratud lähtepunkti või vähese sihtgeeniekspressiooni tõttu suudame kogu RNA taaskasutada ja ikkagi ei paku piisavalt malle, et saada hea reaalajas signaal?
Sel juhul võib eelvõimenduse etapp olla väga kasulik.
Järgnev on skeem tundlikkuse suurendamiseks pärast pöördtranskriptsiooni.Enne alustamist peame küsima allavoolu, millised sihtmärgid meid huvitavad, et kavandada nende sihtmärkide jaoks spetsiifilised praimerid eelvõimendamiseks.
Seda on võimalik saavutada, luues segapraimeri kuni 100 paari praimereid ja reaktsioonitsüklit 10-14 korda.Seetõttu on saadud cDNA eelamplifitseerimiseks vaja spetsiaalselt selle nõude jaoks loodud Master Mixi.
Tsüklite arvu vahemikku 10–14 määramise põhjus on see, et see piiratud arv tsükliid tagab erinevate sihtmärkide vahelise juhuslikkuse, mis on kvantitatiivset molekulaarset teavet vajavate teadlaste jaoks ülioluline.
Pärast eelamplifikatsiooni saame suure hulga cDNA-d, nii et tagaotsa tuvastamise tundlikkus paraneb oluliselt, ja saame isegi proovi lahjendada ja võimalike juhuslike vigade kõrvaldamiseks teha mitu reaalajas PCR-reaktsiooni.
Postitusaeg: 11. aprill 2023